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“鬼峰解决方案”----月旭微信技术讲座笔录

发布时间:2016-07-06        内容来源:月旭科技

现在将从3个方面给大家掰扯掰扯这个鬼峰。
第一,鬼峰是个“什么鬼”
第二部分,鬼峰你是来自何方的“妖孽”
第三部分,鬼峰看我怎么收拾你



我用了一个词语“神出鬼没”来形容这个鬼峰,大家应该也深有体会,飘忽不定,是个很不讨喜的东西。嗯,用个完整的句子呢就是,在某个谱图里出现,可能同样的条件再做一次又不出现了,时有时无,没有规律的异常色谱峰。



我们说“神出鬼没”是不是真的就是天外飞仙,来无影去无踪呢,其实也不是了,我们可以从很多方面去寻找其踪迹。所以下面就是要找到其来源。鬼峰你是来自何方的“妖孽”?

我们的色谱条件中分为等度和梯度两种模式,那先看看等度条件下,鬼峰的可能来源,第一考虑样品的溶剂,样品溶剂我们可以用流动相或者别的溶剂,一般情况下,尽量用流动相或与流动相性质差异不大的溶剂。一方面为了减小溶剂效应导致的峰形异常,另一方面就是减少溶剂差异导致的出峰。流动相作为溶剂会在死时间出峰,只要在这个地方没有弱保留物质,可以不用管,但是如果用了与流动相极性差异大的溶剂,在色谱系统中经过色谱分配而在死体积出峰就是很讨厌的了。要想办法查来源,排干扰。就是除流动相外的任何溶液都会干扰流动相和固定相之间的平衡,从而导致峰出现。

 

另外,是否用了回收流动相?这事儿我是干过,为了节约成本,我做中药,鬼峰也不怕,只要不干扰我的目标峰,管你是什么鬼,回收流动相可能是正峰,也可能是倒峰。出现空穴色谱,这些峰叫做空穴峰,空穴色谱在工业流程气体的控制中,用于气体组分分布,操作呢就是以被分析样品或用载气稀释的样品作为流动相,把一定量的绝载体像进样一样通过色谱柱。在通过色谱系统后,也得到一个个分离后的组分峰,这些峰通常叫空穴峰。

在液相中,回收的流动相中有前面进的样品,所以也会出现这种空穴峰,而这些峰与你回收流动相的组分差异而不重现,所以也列为鬼峰之一。

 

下面看一下梯度条件下的鬼峰,这也是我们平时遇到的最多的,也是最难解决的,除了等度模式下的情况,梯度鬼峰来源更多的是溶液杂质,特别是流动相各成分中的,因为梯度模式一般都是由低洗脱能力溶剂作为起始流动相,这时流动相中的微小成分和杂质会在柱子上富集,随着梯度的运行,洗脱能力的改变,这些物质就会像样品一样在柱子上脱离,从而在我们的色谱图上出峰。

梯度中出现的杂质主要来源是水,因为水易受污染而且用量相对较大,水的污染源可来源于净化系统本身,存储容器引入或是放置时间太长生长了细菌。因此,我们建议水相通过反相梯度空白基线来监视,购买HPLC用水,这个水是比较贵的了。

第二是与检测器有关,即使用了高品质的溶液或溶剂,还是会生峰,这和检测器有关,比如示差检测器,对流动相折射率的改变是比较敏感的,是会出峰的。用了紫外检测器,在特定的波长下,溶剂本身也会有吸收,这时的梯度背景更像一个圆包而不是一堆峰。

 

看一下不同品质的水,梯度洗脱模式下,在210nm和254nm下的出峰情况,超纯水相对来说比较少,三蒸水和实验室用水就是平时清洗玻璃器皿的蒸馏水,这个图简直是惨不忍睹了,肯定是不能用于液相色谱的。

 

梯度变化出峰,一般出现在使用紫外检测器的情况下,随着两相比例的改变,基线有一定改变,当变化速率很大时就会出现一个梯度峰,通常这类峰比较尖锐,峰底会落到基线以下。

 

样品残留,这种现象在做高浓度样品时较易出现,在空白中发现峰,峰会随着进样针数的增加,峰面积会越来越小,这种现象也和填料本身性质有一定关系,不同载碳量的填料,载样量不一样。

 

鬼峰的再一个来源是系统被污染了,使用了纯度不够的试剂、样品残留太多、变质的流动相,这些物质里面的成分都会参与到色谱的分配中去,从而出现不重现的峰。

 

样品前处理中样品被污染导致的出峰。来源可能有器皿清洗不干净引入的,特别是反复使用的样品瓶,容量瓶,玻璃移液管等这种不易清洗干净的器皿,另一方面就是过滤膜,或者是过滤头的外壳材质被溶剂溶解引入,溶剂对存放容器有溶解作用,特别是用塑料器皿存放有机溶剂,或是对样品瓶垫有溶解力。

 

样品溶液中的难洗脱成分,在中药材及其制剂等成分复杂的样品时较常发生。由于这类物质在色谱中保留太强,需要较长时间才能洗脱,而每次停止采集和进样阀时间间隔不一致,导致出峰时间和峰面积都不稳定,一般这样情况建议最后用强洗脱能力溶剂较长时间冲洗保证物质完全被洗脱。

 

好了,我们已经通过以上七大姑八大姨的类型确定了鬼峰的来源,那下面就是尽可能的排除他,以获得一张满意的色谱图。

鬼峰,看我怎么收拾你?
我们先把来源作个思路整理,第一是排除样品的前处理引入,重新配样,解决思路是使用新的、清洗烘干后的器皿处理样品,不用过滤膜,高速离心进样,及时分析,避免样品降解。

 

排除仪器被污染的可能性,更换仪器,最好是一台一直没有检测过该样品的仪器,清洗仪器,选择全新的色谱柱,排除柱残留。

 

试剂是鬼峰的最大来源,建议是运行空针,再每种试剂单独进样,比如说流动相是乙腈-20mmd H2PO4用磷酸调PH=3.0,那单独进样试剂有乙腈、水、20mmd H2PO4、磷酸调水的PH=3.0,看看哪种溶剂引入了峰,再针对该种溶剂进行纯度提高,品牌更换。

 

解决问题方面的小结。
第一,充分了解你样品的性质,让样品不要在系统中沉淀或者有过多残留,了解样品组分,避免强保留组分出峰太晚而出现在下一张色谱图上。
第二,保证前处理器皿,仪器干净。
第三,对引起鬼峰的溶剂进行更换。
第四,使用专属性更强的检测波长,避开溶剂吸收波长

 

但也会出现一种情况,就是怎么弄都去除不了,这种是最抓狂的。

 

今天给大家带来了一个收鬼峰最强的“法器”,Ghost Buster流动相杂质捕集小柱,用于去除流动相和容器中产生的杂质。对样品引入的杂质是无效的。

 

该小柱是连接在混合器和样品阀之间,也可以是水相流路那上面,不能过样品,要不然把样品吸附了。

 

先给大家看个案例,条件是水、乙腈走一个梯度,样品就是水。

 

这个是没有捕集柱的,太多鬼峰了。

 

 

加了杂质捕集小柱,整个图都变得好多了,水里面的杂质都得到有效吸附,如果流动相的水相就是水,一般情况下是溶于水的有机污染物。来源可能是实验室空气中的VOC,所以效果是很好的。

各位可能会有疑问,这些东西会不会被洗脱下来,这个是个很好的问题。这款小柱采用的是月旭特殊处理,需要保密的一种填料,对这些污染物是一种死吸附,目前为止还没有发现有溶剂能将上面吸附的污染物洗脱下来,当然也可能是我们没有发现,欢迎大家发现其他方面的应用情况,多给我们提意见。

 

对比效果就更明显了。

 

应用案例,恩曲他滨

 

溶剂空白对比图,用了捕集柱,杂质明显少了很多,而且基线也平缓了不少。

 

看一下样品,不加捕集柱,在20min左右有很多杂峰。

 

上了捕集柱,干扰就去了很多。

 

看一下案例三

 

加捕集柱和不加捕集柱的对比效果图

 

小结一下,这款捕集柱的一些优点,有效去除流动相引入的鬼峰,耐受常规方法使用的水和各种有机溶剂,缓冲盐,易于安装拆卸,就像安装色谱柱一样简单,寿命很长。看了这些数据,我觉得大家应该对我们这个小柱产生比较大的兴趣了。

 

这款捕集柱的使用注意事项

 

下面是小结

 

下 载

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